ДЕЙСТВУЮЩИЕ ЛИЦА:
- БИОЛОГ,
- ФИЗИОЛОГ,
- СЕЛЕКЦИОНЕР,
- ВРАЧ,
- ГЕНЕТИК,
- УЧЕНИКИ,
- ВЕДУЩИЕ.
ВЕДУЩИЙ. В истории науки известно немало примеров, когда открытия, казавшиеся чистой игрой ума и не имевшие, на первый взгляд, никакого практического значения, впоследствии приводили к революционным изменениям в промышленности или сельском хозяйстве.
Биология растительной клетки вне организма (in vitro) – очень молодой, бурно развивающийся раздел физиологии растений.
Термин in vitro (дословно “в стекле”) означает, что объекты выращиваются изолированно от целого организма и стерильно, т.е. в асептических условиях.
ВЕДУЩИЙ. Впервые растущая клетка моркови получена в лаборатории Р.Готре (Франция) всего чуть более полувека назад. Вначале исследователи изолированных растительных клеток не придавали практического значения своим работам. Однако сейчас почти все современные растительные биотехнологии основаны на культуре клеток растений.
УЧЕНИК. Кто в России стоял у истоков создания биологии растительной клетки вне организма?
БИОЛОГ. Можно утверждать, что представление о культуре высших растений как об уникальной экспериментально созданной биологической системе возникло во многом благодаря трудам Р.Г. Бутенко и ее сотрудников. Целый ряд биологии клетки и биотехнологии имели и имеют приоритетный характер.
УЧЕНИК. Как можно получить культуру клеток высших растений?
ФИЗИОЛОГ. Культуру клеток высших растений получить на первый взгляд очень просто. Достаточно в асептических (стерильных) условиях взять кусочек любого органа или ткани растения и поместить на специально подобранную твердую (с добавлением агара) питательную среду. В составе среды должны быть минеральные соли, сахар (для питания клеток) и, главное, - регуляторы роста (фитогормоны).
Через какое-то время произойдет дедифференциация – клетки потеряют свою исходную специализацию. Это означает, что они перестанут быть, к примеру, “клеткой листа” или “клеткой паренхимы стебля”, а станут своеобразными “унифицированными” растительными клетками. Затем эти клетки начинают делиться. Последняя представляет собой сообщество делящихся и растущих клеток (“каллусной” она называется из-за сходства с каллусом – раневой тканью растения).
После определенного периода роста (обычно около месяца) небольшую часть каллуса пересаживают на свежую питательную среду для нового ростового цикла. Таким образом, т.е. серией пересадок, постепенно поддерживается растущая культура клеток растений.
УЧЕНИК. Какова судьба свободноживущих клеток растений в культуре?
ФИЗИОЛОГ. Судьба клеток в составе организма жестко определена. Для регуляции развития и работы своих клеток у растений есть много способов. Прежде всего, это действие фитогормонов: ауксинов, цитокининов, гиббереллинов, абсцизовой кислоты, этилена и нескольких других относительно недавно открытых соединений. Другой фактор, определяющий судьбу клетки, представляет ее окружение – соседние клетки и ткани. Механизмы, определяющие влияние такого окружения на судьбу клетки, до конца не установлены, известно лишь, что большую роль в них играют электрические сигналы и контактные взаимодействия.
УЧЕНИК. Значит, клетки входящие в состав культуры клеток все одинаковые?
ФИЗИОЛОГ. Когда исследователи только начинали работу со свободноживущими клетками растений, то не вызывало сомнений, что все клетки в культуре одинаковы (ведь получены они из немногих клеток одной ткани!).
Решающим поворотом в изучении биологии клетки in vitro стало открытие гетерогенности входящих в нее клеток. Оказалось, что входящие в состав культуры клетки значительно различаются друг от друга, причем по разным признакам: морфологическим, физиологическим, генетическим. Установлено, что свободноживущие клетки in vitro содержат различный набор хромосом – от гаплоидного до окта- и декаплоидного, при этом часто наблюдаются различные хромосомные перестройки. И, наконец, важнейшее свойство, присущее свободноживущей клетке in vitro, - она может дать начало новому целому растению. Процесс формирования из дедифференцированных клеток дифференцированных структур: тканей, органов, целого организма растения – получил название морфогенеза in vitro , а появление интактного растения из отдельного протопласта, клетки или группы клеток – регенерации.
УЧЕНИК. Назовите наиболее важные области практического использования культур клеток высших растений.
БИОЛОГ. В настоящее время важные области практического применения культур клеток высших растений – экология, растениеводство, промышленная биотехнология.
УЧЕНИК. А как в экологии используется культура клеток высших растений?
ЭКОЛОГ. В настоящее время многие виды растений исчезли с лица Земли, многие находятся на грани исчезновения. Культура клеток – эффективное средство сохранения генофонда вида, а также уникального генотипа штаммов-продуцентов. Существует несколько способов сохранения генотипов. Клетки “вне организма” можно сохранять как в живой пересадочной коллекции, так и депонировать (хранить) их при низких и сверхнизких температурах (в жидком азоте). Такой способ хранения получил название криосохранения, или криоконсервации.
Работы по криосохранению штаммов-продуцентов проводятся свыше 20 лет, и к настоящему времени в криобанке хранятся более 20 линий и штаммов-продуцентов. Это уникальные штаммы диоскореи дельтовидной – продуцентов фуростаноловых гликозоидов, женьшеня настоящего, американского и японского – продуцентов специфических гликозидов и ряд других ценных штаммов.
УЧЕНИК. Как культура клеток используется в растениеводстве?
СЕЛЕКЦИОНЕР. Методы культивирования клеток и тканей культурных растений in vitro применяются как для повышения эффективности традиционных способов селекции, так и для выполнения задач, которые не могут быть решены стандартным путем.
Создание генетического разнообразия – обязательный начальный этап любых селекционных программ. Традиционные способы расширения генетического разнообразия – внутривидовая и отдаленная гибридизация. Цель последней – передать от дикорастущих родственных видов культурным сортам ценные гены устойчивости к болезням и неблагоприятным факторам окружающей среды.
Ученик. Какие важные открытия в области чистоты гамет были предприняты селекционерами?
СЕЛЕКЦИОНЕР. Мечта любого селекционера – иметь для работы полностью гомозиготное растение, в этом случае в поколениях не будет происходить расщепление и селекционный процесс существенно сократится.
В 1964 г. индийские исследователи С. Гуха и С. Магешвари открыли возможность получения in virto гаплоидов при культивировании пыльников на искусственных питательных средах с добавлением гормонов.
Гаплоидные растения развивались из незрелых пыльцевых зерен. Установлено, что развитие пыльцевых зерен в условиях in vitro может происходить по спорофитному пути, т.е. они будут вести себя как обыкновенные растительные клетки in vitro, в частности, могут делиться и образовывать соматические эмбриоиды. Однако поскольку клетки пыльцы гаплоидны, то и соматические эмбрионы тоже будут состоять из гаплоидных клеток. Процесс получения растений из пыльцы назван андрогенезом. Впоследствии были подобраны условия создания гаплоидных растений и из семязачатков (неоплодотворенных зародышей). Такой способ производства гаплоидных растений получил название гиногенез.
Метод андрогенеза широко применяется в селекции злаковых и овощных культур. В ряде стран на основе использования культуры пыльников созданы высокоурожайные и устойчивые к неблагоприятным факторам сорта. Например, в Китае андрогенетические сорта пшеницы занимают площадь 70 тыс.га, а риса – 10 тыс.га. Технология получения удвоенных гаплоидов ячменя и картофеля применяется на Украине (Харьков, Институт растениеводства, Одесса, Селекционно-генетический институт, Институт картофелеводства УААН, Киевская область). В России на основе метода андрогенеза созданы улучшенные высокоурожайные сорта риса (Краснодарский край), пшеницы, ячменя, моркови, проса.
Метод культуры пыльников не только ускоряет селекционный процесс, но и делает его более эффективным.
Методами традиционно селекции не удалось получить рано созревающий рис с удлиненной зерновкой. На основе сомаклональной изменчивости и клеточной селекции получен сорт риса БИОРИЗА, сочетающий скороспелость, длиннозернистость и продуктивность.
Благодаря кокультивированию in vitro растений с пораженными тканями и зооспорангиями разработаны системы для отбора клеток и растений, устойчивых к возбудителям рака картофеля и парши обыкновенной.
УЧЕНИК. Как быстро и эффективно размножаются ценные генотипы?
ГЕНЕТИК. После отбора удачных генотипов встает проблема их сохранения и активного размножения. На основании изучения экспериментального морфогенеза in vitro cоздана технология клонального микроразмножения растений, которая во многих странах стала уже коммерческой. Клональное размножение – разновидность вегетативного размножения с использованием техники in vitro. Оно применяется для быстрого получения большого количества растений, идентичным исходным.
Клональное микроразмножение растений можно осуществлять разными способами. Наиболее распространены среди них:
- микрочеренкование пробирочных растений;
- инструкция образования микроклубней и микролуковиц;
- изоляция почек или меристем с последующим их культивированием на средах с фитогормонами и индукцией побегообразования.
Преимущество клонального микроразмножения по сравнению с традиционными методами заключается в значительно более высоком коэффициенте размножения. При клональном микроразмножении можно получать до 100 тыс. растений в год, тогда как при обычном размножении – 5-100 растений за тот же срок.
Метод клонального микроразмножения широко используется для получения большого количества посадочного материала у декоративных и овощных культур. Это превосходный способ вегетативного размножения ценных гибридных растений, позволяющих сохранить эффект гетерозиса. В ряде стран, в том числе и в России, существуют промышленные технологические линии по размножению цветочных культур и других растений методами культуры in vitro. В подмосковном колхозе им. Ленина еще в конце 70-х годов прошлого века было налажено крупномасштабное микроклональное размножение гвоздики элитных сортов, герберов, фрезии. Общее количество получаемых растений составляло более 5 млн. Штук в год.
СЕЛЕКЦИОНЕР. В качестве другого примера можно назвать размножение и оздоровление семенного материала картофеля. Применяются методы термо- и химиотеропии для освобождения апикальных меристем от разных видов вирусов. Метод основан на вычленении апикальных меристем размером 100-200 мкм и регенерации из них in vitro растений.
Давно отработана система размножения пробирочных растений картофеля и получения мини-клубней в условиях теплицы. В настоящее время широко внедряются методы получения мини-клубней картофеля в гидропонных условиях (фирма “Дока”), а также с использованием “ионитопонной” культуры – на твердых субстратах. В ИФР РАН разработан уникальный метод получения и массового размножения картофеля с использованием биореакторов, обеспечивающих полную стерильность процесса.
ВОПРОС ИЗ ЗАЛА. А как обстоит дело с древесными растениями?
СЕЛЕКЦИОНЕР. В последние годы успешно разрабатываются технологии размножения древесных растений. Так, в Красноярском Институте леса СО РАН ведется работа по сохранению генофонда и воспроизведению уникальных гетерозисных форм сибирских видов хвойных. Комплексный подход, включающий оздоровление, клональное микроразмножение и депонирование посадочного материала при пониженных температурах, используются для поддержания ценных сортов плодовых и ягодных растений в Селекционно-технологическом институте садоводства и питомниководства РАСХН (Москва). До 70% элитного картофеля выращивается с использованием методов оздоровления.
В тех случаях, когда методами традиционной селекции не удается получить гибридные растения, применяют еще одну клеточную биотехнологию – слияние изолированных протопластов.
ВОПРОС ИЗ ЗАЛА. А что такое протопласты?
ФИЗИОЛОГ. Протопласт представляет собой клетку, лишенную клеточной стенки. Разработан ряд примеров, способствующих слиянию протопластов, выделенных из разных растений. Гибридизацией протопластов можно получить не только межвидовые, но и межродовые гибриды. В отличие от половой гибридизации при слиянии протопластов создаются новые комбинации ядерного и цитоплазматического геномов. Для получения гибридов у одного из сливающихся протопластов удаляют или инактивируют ядро.
Межвидовую соматическую гибридизацию, в частности, используют для переноса генов устойчивости из диких видов в культурные. Например, слиянием протопластов картофеля сорта Приекульский ранний с протопластом дикого вида Solatium chacoense в ИФР РАН получен соматический гибрид, имеющий ряд хозяйственно важных признаков.
ВОПРОС ИЗ ЗАЛА. Как этот метод используется в генетической инженерии?
ГЕНЕТИК. Генетическая инженерия в настоящее время – “модный” раздел растительной биотехнологии. Суть ее состоит во введении нужного гена (генов) – часто их называют “генами интереса” - в растительный организм. “Гены интереса” могут иметь различное происхождение (из бактерий, грибов, животных или даже быть синтетическими) и определять различные свойства: устойчивость растения к биотическим и абиотическим стрессовым факторам, отвечать за синтез ценных белков и др.
Для успешного введения конструкции в геном растений обычно применяют агробактериальную трансформацию, т.е. используют системы “природного генного инженера” - патогенной почвенной бактерии Agrobacterium tumefaciens Агробактериальная трансформация, однако, эффективна только для двудольных растений, патогенном которых является агробактерия.
ВОПРОС ИЗ ЗАЛА. А не навредят ли трансгенные растения?
ГЕНЕТИК. В мире сейчас получены трансгенные растения более чем 80 сельскохозяйственных культур. Среди них важнейшие зерновые культуры (пшеница, рис, кукуруза), овощные (томаты, картофель, сладкий перец), масличные (соя, рапс). Однако большинство из перечисленных трансгенных растений создавались на основе сортов и линий иностранной селекции, не пригодных к выращиванию в агроклиматических условиях России.
В 1997 году площадь, занятая под посевами трансгенных сельскохозяйственных культур, в мире увеличилось в 4,5 раза по сравнению с 1996 годом.
В качестве примера практического использования генной инженерии в нашей стране можно привести работы с картофелем, соей, кукурузой.
Для выявления безопасности трансгенных растений необходимы длительные многоплановые исследования. Именно длительные, поскольку последствия могут проявиться в поколениях как ГМО, так и использующих организм.
Вот почему, не отрицая важность и эффективность использования трансгенных организмов в практике, следует признать необходимым строгий контроль за их использованием, тщательное и всестороннее исследование их безопасности и обязательное маркирование всех трансгенных продуктов, поступающих на рынок.
ВОПРОС ИЗ ЗАЛА. Применяется ли этот метод в промышленной биотехнологии?
БИОЛОГ. В промышленной биотехнологии культура клеток чаще всего используется для получения физиологически активных веществ для медицины, косметики, пищевой промышленности.
ВРАЧ. В настоящее время повышается интерес к лекарствам и продуктам растительного происхождения (фитопрепаратам). Фитопрепараты обеспечивают эффективную профилактику и лечение сердечно-сосудистых, инфекционных, нейродегенеративных, онкологических и других заболеваний.
ВОПРОС ИЗ ЗАЛА. А не ли отрицательных сторон у этого направления?
ВРАЧ. Есть, как минимум две отрицательные стороны.
1. Заготовка растительного сырья приводит к сокращению ценных природных растительных ресурсов и даже к исчезновению целых видов растений. Так, лишь для медико-биологических исследований нового противоопухолевого препарата таксола было уничтожено 12 тыс. взрослых растений тиса; практически полностью исчезли в дикорастущем состоянии женьшень, кирказон маньчжурский, солодка, золотой и маралий корень и др. Выращивание ценных растений на плантациях часто оказываются нерентабельным.
2. Растения, выросшие в природных условиях или на плантациях, обычно содержат значительное количество токсичных примесей; гербицидов, пестицидов и др.
ФИЗИОЛОГ. Культура клеток высших растений – эффективный способ получения растительного сырья для медицины, ветеринарии, парфюмерии, пищевой промышленности. Суть его состоит в получении биомассы культуры клеток растения в стерильных биореакторах большого объема. Преимущества такого использования культур клеток достаточно ощутимы:
- практически абсолютная экологическая чистота процесса выращивания культуры клеток;
- гарантированное получение растительной биомассы с заданными характеристиками независимо от сезона, климатических и погодных условий;
- высокая скорость получения биомассы – до 2 г сухой биомассы с одного литра среды за сутки;
- гарантированное отсутствие в биомассе пестицидов, гербицидов, радиоактивных соединений и др.
- возможность использования для получения биомассы стандартного оборудования микробиологических производств.
ВОПРОС ИЗ ЗАЛА. А в настоящее время, где наиболее перспективно использование культур клеток?
ФИЗИОЛОГ. В настоящее время наиболее перспективно использование культур клеток для получения:
- противоопухолевых препаратов типа таксола, камптотецина;
- антивирусных препаратов, особенно анти-ВИЧ;
- адаптогенных и стимулирующих препаратов как галеновых, так и индивидуальных биологически активных веществ растительного происхождения – гинзенозидов;
- терпеноидных гликозидов с широким спектром активности – от подсластителей до иммуностимуляторов.
ВОПРОС ИЗ ЗАЛА. Какая страна занимает первое место в мире по производству биомассы культур клеток?
ФИЗИОЛОГ. Россия, занимает первое место в мире по промышленному производству культур клеток. Еще в 70-х годах на ряде заводов Главмикробиопрома было организовано производство биомассы культуры клеток женьшеня. На ее основе созданы медицинские препараты (настойка “Женьшень”) и косметические средства (шампунь “Диона”, лосьон “Женьшеневый” и др.) В настоящее время из культуры клеток полисциаса производится нутрицевтик (пищевая добавка) “Витагмал”. Установлены адаптогенные и антистрессовые свойства названного препарата. Особенно он эффективен для пренатальной (дородовой) безопасности и при постинфарктных состояниях. На завершающей стадии находится разработка препарата фурастоноловых гликозидов “Диофур”.
За рубежом известны несколько примеров получения лекарственных препаратов на основе культур клеток высших растений.
ВЕДУЩИЙ. Сегодня, вы узнали много нового о культуре высших растений, об их использовании в экологии, растениеводстве, промышленной биотехнологии.
Много сделано, но предстоит сделать еще больше. У этого направления биологии большое будущее.